Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14391:2025 về Phân bón - Định lượng Bacillus mycoides bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) kết hợp giải trình tự gen

Tóm tắt mang tính tham khảo.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14391:2025 về Phân bón - Định lượng Bacillus mycoides bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) kết hợp giải trình tự gen là văn bản kỹ thuật quan trọng quy định phương pháp luận thống nhất nhằm xác định chính xác mật độ vi khuẩn Bacillus mycoides trong các sản phẩm phân bón vi sinh vật tại Việt Nam. Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định quy trình định lượng vi khuẩn Bacillus mycoides bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng, kết hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại bao gồm phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và giải trình tự gen để khẳng định sự hiện diện của chủng vi sinh vật này trong mẫu phân bón. Đối tượng áp dụng: Tiêu chuẩn áp dụng đối với các phòng thử nghiệm, tổ chức chứng nhận hợp quy, cơ quan quản lý nhà nước về chất lượng phân bón, cùng các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh và khảo nghiệm phân bón vi sinh vật có chứa chủng Bacillus mycoides tại Việt Nam. Nguyên tắc của phương pháp thử nghiệm Giai đoạn định lượng (Đếm khuẩn lạc): Mẫu phân bón được chuẩn bị và pha loãng theo dãy thập phân bằng dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành cấy trải hoặc cấy trộn dịch pha loãng lên môi trường thạch dinh dưỡng. Sau thời gian nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ tối ưu, tiến hành đếm các khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của Bacillus mycoides (thường là khuẩn lạc dạng sợi, lan rộng giống hình rễ cây). Giai đoạn khẳng định (PCR và giải trình tự gen): Do hình thái khuẩn lạc của nhóm Bacillus cereus (bao gồm cả Bacillus mycoides) có thể có những điểm tương đồng, tiêu chuẩn bắt buộc sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự gen (như gen 16S rRNA hoặc các gen đích đặc hiệu khác) và so sánh với cơ sở dữ liệu chuẩn để khẳng định chính xác loài Bacillus mycoides. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường nuôi cấy Thiết bị và dụng cụ phòng thử nghiệm: Yêu cầu trang bị đầy đủ các thiết bị vi sinh và sinh học phân tử cơ bản bao gồm tủ ấm duy trì nhiệt độ ổn định, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), tủ an toàn sinh học cấp II, máy ly tâm tốc độ cao, máy chu kỳ nhiệt (PCR), hệ thống điện di gel agarose kèm nguồn điện và buồng đọc gel, cùng hệ thống hoặc dịch vụ giải trình tự gen liên kết. Hóa chất và môi trường: Sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng tiêu chuẩn (Nutrient Agar hoặc các môi trường chuyên biệt tương đương), nước muối sinh lý peptone (MRD) hoặc dung dịch đệm phosphat để pha loãng mẫu. Các hóa chất phục vụ sinh học phân tử bao gồm bộ kit tách chiết DNA vi khuẩn, hỗn hợp phản ứng PCR (MasterMix), cặp mồi đặc hiệu cho Bacillus mycoides, nước không chứa nuclease và các chất chuẩn điện di. Quy trình tiến hành thử nghiệm chi tiết Bước 1: Chuẩn bị và pha loãng mẫu thử: Cân chính xác một lượng mẫu phân bón đại diện (thường là 10g hoặc 10ml) cho vào bình tam giác chứa dung dịch đệm pha loãng để đạt được độ loãng ban đầu (10 mũ -1). Tiến hành lắc đều để đồng nhất mẫu, sau đó thực hiện pha loãng bậc mười liên tiếp để thu được các nồng độ pha loãng phù hợp cho việc đếm khuẩn lạc. Bước 2: Nuôi cấy và đếm khuẩn lạc: Hút một thể tích dịch mẫu đã pha loãng (thường là 0,1ml cho phương pháp cấy trải hoặc 1ml cho phương pháp cấy trộn) cho vào các đĩa thạch dinh dưỡng. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ từ 28 độ C đến 30 độ C trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ. Chọn các đĩa có mật độ khuẩn lạc phù hợp (từ 15 đến 150 khuẩn lạc hoặc theo quy định cụ thể của tiêu chuẩn) để đếm và ghi nhận số lượng khuẩn lạc nghi ngờ có hình thái đặc trưng của Bacillus mycoides. Bước 3: Tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR: Chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa đếm để tiến hành tách chiết DNA genome. Sử dụng DNA đã tách chiết làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế riêng cho Bacillus mycoides. Thiết lập chương trình nhiệt cho máy PCR theo đúng thông số kỹ thuật về nhiệt độ lai, thời gian kéo dài và số chu kỳ phản ứng. Bước 4: Điện di và giải trình tự gen khẳng định: Tiến hành điện di sản phẩm PCR trên gel agarose để kiểm tra sự xuất hiện của vạch DNA mục tiêu có kích thước tương ứng với lý thuyết. Các sản phẩm PCR dương tính được tinh sạch và tiến hành giải trình tự gen. Trình tự nucleotide thu được sẽ được so sánh, đối chiếu với cơ sở dữ liệu gen quốc tế (như GenBank) bằng công cụ BLAST để đưa ra kết luận khẳng định cuối cùng về loài Bacillus mycoides. Tính toán và biểu thị kết quả thử nghiệm Công thức tính toán: Mật độ vi khuẩn Bacillus mycoides trong một đơn vị khối lượng hoặc thể tích mẫu phân bón được tính toán dựa trên tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch được chọn, hệ số pha loãng tương ứng và tỷ lệ phần trăm số khuẩn lạc được khẳng định là Bacillus mycoides thông qua kết quả PCR và giải trình tự gen. Biểu thị kết quả: Kết quả cuối cùng được biểu thị dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc trên một gam mẫu (CFU/g) đối với phân bón dạng rắn hoặc trên một mililít mẫu (CFU/mL) đối với phân bón dạng lỏng, được viết dưới dạng số mũ cơ số 10 (ví dụ: x,xx nhân 10 mũ y CFU/g). Hiệu lực thi hành và điều khoản chuyển tiếp Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14391:2025 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày được công bố bởi cơ quan nhà nước có thẩm quyền. Các tổ chức thử nghiệm và doanh nghiệp hoạt động trong lĩnh vực phân bón vi sinh vật cần chủ động cập nhật trang thiết bị, đào tạo nhân lực và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật theo tiêu chuẩn này để đảm bảo tính pháp lý và độ chính xác của kết quả kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm lưu thông trên thị trường.