Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14387:2025 về Phân bón - Định lượng nấm Penicillium spp. Bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

Tóm tắt mang tính tham khảo.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14387:2025 về Phân bón - Định lượng nấm Penicillium spp. Bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) quy định phương pháp xác định mật độ nấm Penicillium spp. có trong các loại phân bón vi sinh vật và phân bón hữu cơ vi sinh. Phạm vi áp dụng và đối tượng sử dụng Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân hoạt động trong lĩnh vực sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh, kiểm nghiệm và quản lý chất lượng phân bón tại Việt Nam. Đối tượng áp dụng trực tiếp là các loại phân bón có chứa tác nhân sinh học là nấm thuộc chi Penicillium (Penicillium spp.) nhằm đánh giá chất lượng và mật độ vi sinh vật có ích trong phân bón. Nguyên tắc của phương pháp định lượng và khẳng định Kỹ thuật đếm khuẩn lạc: Mẫu phân bón được hòa loãng theo các dãy thập phân thích hợp, sau đó được cấy trên môi trường nuôi cấy chọn lọc phù hợp cho sự phát triển của nấm Penicillium spp. Sau thời gian ủ ở nhiệt độ và điều kiện thích hợp, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên đĩa thạch để tính toán mật độ ban đầu (biểu thị bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc - CFU trên một đơn vị khối lượng hoặc thể tích mẫu). Khẳng định bằng kỹ thuật PCR: Để đảm bảo tính chính xác và loại trừ các sai lệch do các loài nấm khác có hình thái tương tự, các khuẩn lạc nghi ngờ sẽ được chọn lọc để tách chiết DNA. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được thực hiện sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen mục tiêu của chi Penicillium. Kết quả điện di sản phẩm PCR sẽ khẳng định sự hiện diện chính xác của nấm Penicillium spp. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, môi trường nuôi cấy Các thiết bị cơ bản trong phòng thử nghiệm vi sinh bao gồm: tủ ấm, tủ cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng, máy lắc, kính hiển vi. Các thiết bị phục vụ kỹ thuật sinh học phân tử: máy PCR (máy luân nhiệt), hệ thống điện di gel agarose, máy chụp ảnh gel, máy ly tâm tốc độ cao, tủ lạnh sâu bảo quản mẫu và hóa chất. Môi trường nuôi cấy chuyên dụng cho nấm mốc và các hóa chất, enzyme phục vụ quá trình tách chiết DNA, pha phản ứng PCR (như Taq polymerase, dNTPs, đệm phản ứng, mồi đặc hiệu). Quy trình thực hiện cơ bản Chuẩn bị mẫu và pha loãng: Cân một lượng mẫu phân bón xác định, hòa tan và đồng nhất trong dung dịch đệm pha loãng vô trùng, sau đó tiến hành pha loãng bậc mười liên tiếp. Nuôi cấy và đếm khuẩn lạc: Cấy dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa môi trường thạch, ủ ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ thích hợp trong khoảng thời gian quy định. Theo dõi và đếm các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái đặc trưng của Penicillium spp. Tách chiết DNA và thực hiện PCR: Thu nhận sinh khối từ khuẩn lạc nghi ngờ, tiến hành ly giải tế bào để thu hồi DNA tinh sạch. Thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt tối ưu hóa cho cặp mồi đặc hiệu. Điện di và đọc kết quả: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, nhuộm và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (UV) hoặc hệ thống đọc gel để xác định vạch sản phẩm có kích thước tương ứng với đối chứng dương. Tính toán và biểu thị kết quả Mật độ nấm Penicillium spp. trong mẫu phân bón được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch ở các độ pha loãng được khẳng định là Penicillium spp. bằng phản ứng PCR. Kết quả cuối cùng được biểu thị dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên một đơn vị khối lượng (g) hoặc thể tích (ml) mẫu phân bón. Hiệu lực thi hành Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14387:2025 có hiệu lực kể từ ngày ban hành theo quyết định của cơ quan nhà nước có thẩm quyền, cung cấp cơ sở kỹ thuật thống nhất cho việc kiểm nghiệm và quản lý chất lượng các sản phẩm phân bón vi sinh chứa nấm Penicillium spp. trên thị trường.