Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14113:2024 về Phân bón - Định lượng Bacillus subtilis bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và PCR

Tóm tắt mang tính tham khảo.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14113:2024 về Phân bón - Định lượng Bacillus subtilis bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và PCR quy định phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis trong các loại phân bón vi sinh vật. Tiêu chuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng phân bón vi sinh, đảm bảo hiệu quả sử dụng và an toàn cho cây trồng cũng như môi trường. Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân bón bằng cách kết hợp phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử PCR để định danh xác nhận. Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các cơ quan quản lý nhà nước, phòng thử nghiệm, tổ chức chứng nhận hợp quy, cùng các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh và khảo nghiệm phân bón vi sinh vật tại Việt Nam. Nguyên tắc của phương pháp định lượng Phương pháp dựa trên việc giải phóng các tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu phân bón vào dung dịch pha loãng thích hợp. Tiến hành nuôi cấy dịch pha loãng trên môi trường dinh dưỡng thạch để các tế bào sống phát triển thành các khuẩn lạc có thể quan sát và đếm được. Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra, xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải là Bacillus subtilis hay không, từ đó loại trừ các sai số do nhiễm tạp khuẩn. Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy Thiết bị và dụng cụ: Yêu cầu sử dụng các thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh tiêu chuẩn bao gồm tủ ấm duy trì nhiệt độ ổn định, nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy vô trùng (laminar), máy ly tâm, máy nhân gen PCR, và hệ thống điện di gel agarose để phân tích sản phẩm PCR. Môi trường và hóa chất: Sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng phù hợp cho sự phát triển của Bacillus subtilis, nước muối sinh lý hoặc dung dịch đệm peptone để pha loãng mẫu, cùng các hóa chất tách chiết DNA và bộ kit PCR chuyên dụng. Quy trình thực hiện định lượng và định danh Chuẩn bị và pha loãng mẫu: Cân một lượng mẫu phân bón xác định, hòa tan và đồng nhất trong dung dịch pha loãng, sau đó tiến hành pha loãng bậc mười liên tiếp để đạt được nồng độ khuẩn lạc thích hợp cho việc đếm. Nuôi cấy và đếm khuẩn lạc: Cấy dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa môi trường thạch bằng phương pháp cấy gạt hoặc cấy đổ đĩa. Ủ các đĩa cấy ở nhiệt độ từ 30 độ C đến 37 độ C trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ. Tiến hành đếm các khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus subtilis xuất hiện trên đĩa. Xác nhận bằng kỹ thuật PCR: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện tách chiết DNA. Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen của Bacillus subtilis. Chạy điện di sản phẩm PCR để xác định sự hiện diện của băng vạch DNA đặc trưng. Tính toán và biểu thị kết quả Mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis trong mẫu phân bón được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa cấy, hệ số pha loãng và tỷ lệ số khuẩn lạc được xác nhận là Bacillus subtilis qua phản ứng PCR. Kết quả cuối cùng được biểu thị dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên một gam (CFU/g) đối với phân bón dạng rắn hoặc trên một mililít (CFU/mL) đối với phân bón dạng lỏng. Hiệu lực thi hành Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14113:2024 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày ban hành, thay thế hoặc bổ sung cho các phương pháp thử nghiệm trước đây nhằm nâng cao độ chính xác và tính thống nhất trong công tác kiểm nghiệm chất lượng phân bón vi sinh tại Việt Nam.