Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14444:2025 (BS EN 14526:2017) về Thực phẩm - Xác định độc tố nhóm saxitoxin trong nhuyễn thể có vỏ - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có tạo dẫn xuất trước cột và oxy hóa bằng peroxide hoặc periodat

Tóm tắt

Tóm tắt mang tính tham khảo.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14444:2025 (hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn châu Âu BS EN 14526:2017) quy định phương pháp xác định độc tố nhóm saxitoxin trong thịt của nhuyễn thể có vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có tạo dẫn xuất trước cột và oxy hóa bằng peroxide hoặc periodat. Đây là tiêu chuẩn kỹ thuật quan trọng giúp kiểm soát an toàn thực phẩm đối với các loại thủy hải sản, đặc biệt là các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có nguy cơ tích tụ độc tố sinh học biển gây liệt cơ (PSP - Paralytic Shellfish Poisoning). Phạm vi áp dụng và đối tượng kiểm nghiệm Đối tượng áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các phòng thử nghiệm hóa học, cơ quan kiểm tra chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, và các doanh nghiệp chế biến, xuất khẩu thủy hải sản. Mẫu thử nghiệm: Áp dụng trực tiếp trên các mẫu thịt của nhuyễn thể có vỏ (như nghêu, sò, vẹm, hàu, tu hài, điệp) tươi sống, đông lạnh hoặc đã qua chế biến. Giới hạn xác định: Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng các độc tố nhóm saxitoxin ở hàm lượng thấp, đáp ứng các yêu cầu nghiêm ngặt về giới hạn tối đa cho phép theo quy định của Việt Nam và Liên minh Châu Âu (EU). Nguyên lý của phương pháp thử nghiệm Phương pháp dựa trên việc chiết xuất các độc tố nhóm saxitoxin từ mô thịt nhuyễn thể bằng dung dịch axit axetic loãng dưới tác động của nhiệt độ cao. Dịch chiết sau đó được làm sạch bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) để loại bỏ các hợp chất hữu cơ gây nhiễu. Trước khi phân tích trên hệ thống sắc ký, các độc tố được chuyển hóa thành các dẫn xuất huỳnh quang thông qua phản ứng oxy hóa có kiểm soát bằng dung dịch hydro peroxide (H2O2) hoặc natri periodat (NaIO4). Các dẫn xuất huỳnh quang này được phân tách bằng cột sắc ký pha đảo và định lượng bằng đầu dò huỳnh quang (FLD). Các độc tố nhóm saxitoxin được xác định Độc tố không có nhóm thế sulfocarbamoyl: Saxitoxin (STX), Neosaxitoxin (NEO), Decarbamoylsaxitoxin (dcSTX). Độc tố Gonyautoxin: GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, GTX5 (B1), dcGTX2, dcGTX3. Độc tố nhóm N-sulfocarbamoyl: C1, C2, C3, C4 (tùy thuộc vào điều kiện tối ưu hóa của hệ thống sắc ký). Thiết bị, dụng cụ và hóa chất yêu cầu Thiết bị chính: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tích hợp đầu dò huỳnh quang (FLD) có khả năng cài đặt bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ phù hợp; cột sắc ký pha đảo C18; máy đồng hóa mẫu công suất cao; máy ly tâm đạt tốc độ tối thiểu 3000 vòng/phút; hệ thống lọc chân không và cột chiết pha rắn (SPE C18). Hóa chất và thuốc thử: Chất chuẩn của các độc tố nhóm saxitoxin có chứng nhận độ tinh khiết (CRM); các dung môi dùng cho sắc ký (axetonitril, metanol); axit axetic băng; natri hydroxit; hydro peroxide; natri periodat; amoni axetat và nước cất siêu sạch dùng cho HPLC. Quy trình tiến hành thử nghiệm chi tiết Chuẩn bị và đồng hóa mẫu: Mẫu nhuyễn thể được tách vỏ, lấy phần thịt, rửa sạch bằng nước cất, để ráo và tiến hành đồng hóa hoàn toàn bằng máy đồng hóa để đảm bảo tính đồng nhất của mẫu phân tích. Chiết xuất độc tố: Cân một lượng mẫu đồng hóa xác định vào ống ly tâm, thêm dung dịch axit axetic loãng, lắc đều và đun cách thủy trong thời gian quy định. Ly tâm hỗn hợp để thu lấy dịch nổi phía trên. Lặp lại quá trình chiết để thu hồi tối đa độc tố. Làm sạch dịch chiết (SPE): Cho dịch chiết đi qua cột chiết pha rắn SPE C18 đã được hoạt hóa trước bằng metanol và nước. Thu hồi dịch rửa giải chứa độc tố, điều chỉnh pH về khoảng thích hợp để chuẩn bị cho phản ứng tạo dẫn xuất. Phản ứng oxy hóa tạo dẫn xuất trước cột: Chia dịch chiết đã làm sạch thành các phần nhỏ để thực hiện song song hai phản ứng oxy hóa: phản ứng với hydro peroxide (để xác định các độc tố không có nhóm thế hydroxy ở vị trí N-1 như STX, dcSTX, GTX2,3, GTX5) và phản ứng với natri periodat (để xác định toàn bộ các độc tố bao gồm cả nhóm có nhóm thế hydroxy như NEO, GTX1,4). Phân tích trên hệ thống HPLC-FLD: Tiêm các dung dịch sau phản ứng oxy hóa vào hệ thống HPLC. Sử dụng chương trình dung môi rửa giải gradient thích hợp để phân tách tối ưu các pic độc tố. Đo cường độ tín hiệu huỳnh quang tại bước sóng kích thích khoảng 340 nm và bước sóng phát xạ khoảng 395 nm. Tính toán và biểu thị kết quả: Xác định diện tích pic của từng độc tố trong mẫu thử, so sánh với đường chuẩn của các chất chuẩn tương ứng để tính hàm lượng từng độc tố (tính bằng mg/kg thịt). Sử dụng các hệ số chuyển đổi độc tính tương đương (TEF - Toxicity Equivalency Factors) để quy đổi tổng hàm lượng độc tố về hàm lượng tương đương saxitoxin (STX.eq/kg). Hiệu lực thi hành và áp dụng Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14444:2025 có hiệu lực kể từ ngày ban hành. Việc áp dụng tiêu chuẩn này giúp đồng bộ hóa phương pháp thử nghiệm độc tố sinh học biển của Việt Nam với các tiêu chuẩn quốc tế tiên tiến, hỗ trợ đắc lực cho công tác kiểm soát chất lượng thủy sản xuất khẩu sang các thị trường khó tính như châu Âu, Mỹ và Nhật Bản, đồng thời bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng trong nước.