Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12709-2-22:2024 về Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ hại thực vật - Phần 2-22: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định ngài cải bắp Mamestra brassicae Linnaeus

Tóm tắt mang tính tham khảo.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12709-2-22:2024 về Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ hại thực vật - Phần 2-22: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định ngài cải bắp Mamestra brassicae Linnaeus quy định chi tiết các bước kỹ thuật, phương pháp kiểm tra và nhận dạng loài ngài cải bắp phục vụ công tác kiểm dịch thực vật và bảo vệ cây trồng tại Việt Nam. Phạm vi điều chỉnh và đối tượng áp dụng Phạm vi điều chỉnh: Tiêu chuẩn này hướng dẫn quy trình phát hiện, thu thập mẫu, xử lý mẫu và giám định loài ngài cải bắp (Mamestra brassicae Linnaeus) gây hại trên thực vật. Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân hoạt động trong lĩnh vực kiểm dịch thực vật, bảo vệ thực vật, nghiên cứu khoa học và các cơ quan quản lý nhà nước liên quan tại Việt Nam. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất yêu cầu Thiết bị: Kính hiển vi soi nổi có độ phóng đại tối thiểu từ 10 lần đến 40 lần; kính hiển vi quang học có độ phóng đại từ 100 lần đến 400 lần; hệ thống máy nhân gen PCR và thiết bị điện di (trong trường hợp giám định bằng sinh học phân tử). Dụng cụ: Panh gắp chuyên dụng, kim mũi mác, đĩa petri, ống nghiệm thủy tinh, lam kính, lamen, chổi lông nhỏ và các dụng cụ bảo quản mẫu chuyên dụng khác. Hóa chất: Cồn ethanol (nồng độ 70%, 90% và tuyệt đối), dung dịch kali hydroxit (KOH) hoặc natri hydroxit (NaOH) nồng độ 10% để làm trong mẫu, glycerin, nước cất và các hóa chất tách chiết DNA, hóa chất chạy PCR. Quy trình thu thập và chuẩn bị mẫu giám định Thu thập mẫu: Tiến hành điều tra, phát hiện và thu thập mẫu vật trên các bộ phận của cây ký chủ (đặc biệt là các loài cây thuộc họ Thập tự - Brassicaceae như cải bắp, súp lơ, cải thảo). Thu thập đầy đủ các pha phát hiện được bao gồm trứng, sâu non, nhộng hoặc trưởng thành. Xử lý và bảo quản mẫu: Mẫu sâu non và nhộng được ngâm trong cồn 70% hoặc cồn 90%. Mẫu trưởng thành được bảo quản khô trong các hộp đựng chuyên dụng có chất chống ẩm và chống côn trùng gây hại. Mẫu trứng được giữ trong điều kiện mát hoặc cố định bằng hóa chất phù hợp. Làm tiêu bản: Đối với sâu non hoặc bộ phận sinh dục của ngài trưởng thành, tiến hành ngâm trong dung dịch KOH 10% để làm trong, sau đó rửa sạch bằng nước cất, khử nước qua các thang cồn và lên tiêu bản bằng glycerin hoặc chất gắn chuyên dụng để quan sát rõ các đặc điểm phân loại. Phương pháp giám định đặc điểm hình thái học Giám định pha trứng: Trứng có hình bán cầu, đường kính khoảng 0,6 mm đến 0,7 mm. Bề mặt trứng có các đường gờ nổi dọc chạy từ đỉnh xuống đáy. Màu sắc ban đầu khi mới đẻ là trắng sữa hoặc vàng nhạt, sau đó chuyển sang xám sẫm trước khi nở. Giám định pha sâu non (ấu trùng): Sâu non có 6 tuổi phát triển. Đặc điểm nhận dạng cốt lõi bao gồm đầu màu nâu vàng hoặc nâu đen; thân có màu sắc biến động mạnh từ xanh lục đến nâu xám hoặc đen; có một đường sọc rộng màu vàng hoặc cam chạy dọc hai bên hông cơ thể; trên các đốt bụng có các vết đốm đen hình nêm đặc trưng. Giám định pha nhộng: Nhộng thuộc dạng nhộng trần, chiều dài từ 18 mm đến 24 mm, màu nâu đỏ đến nâu sẫm bóng. Phần cuối bụng (cremaster) có hai gai dài, nhọn và hơi cong ở đầu, kèm theo một số gai nhỏ phụ trợ. Giám định pha trưởng thành: Sải cánh của ngài trưởng thành rộng từ 34 mm đến 50 mm. Cánh trước màu nâu xám hoặc nâu đen với các đường vân lượn sóng màu đen và trắng. Điểm nhận dạng quan trọng nhất là vết hình thận (reniform spot) ở giữa cánh trước có viền màu trắng rõ rệt. Cánh sau màu xám nhạt, phần rìa ngoài tối màu hơn. Phương pháp giám định bằng sinh học phân tử Trường hợp áp dụng: Áp dụng khi mẫu vật bị hư hỏng nghiêm trọng, mất các đặc điểm hình thái đặc trưng, hoặc mẫu vật ở pha trứng, sâu non tuổi nhỏ khó định danh chính xác bằng phương pháp hình thái học thông thường. Quy trình thực hiện: Tiến hành tách chiết DNA tổng số từ mẫu vật; thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen chỉ thị COI (Cytochrome c Oxidase subunit I) sử dụng cặp mồi chuẩn; điện di kiểm tra sản phẩm PCR; gửi giải trình tự gen và tiến hành so sánh, đối chiếu trình tự thu được với cơ sở dữ liệu quốc tế (GenBank) để xác định độ tương đồng. Kết luận và lưu trữ hồ sơ giám định Xác định kết quả: Mẫu vật được kết luận là loài ngài cải bắp Mamestra brassicae Linnaeus khi các đặc điểm hình thái học trùng khớp hoàn toàn với mô tả tiêu chuẩn, hoặc kết quả giải trình tự gen COI có độ tương đồng từ 99% trở lên với trình tự chuẩn của loài này trên GenBank. Lập báo cáo: Phiếu kết quả giám định phải ghi đầy đủ thông tin về ký hiệu mẫu, nguồn gốc mẫu, phương pháp giám định, người thực hiện và người phê duyệt. Lưu mẫu: Mẫu vật sau giám định phải được lưu trữ tại phòng thí nghiệm chuẩn theo quy định về lưu trữ mẫu kiểm dịch thực vật để phục vụ công tác hậu kiểm hoặc giải quyết khiếu nại khi cần thiết. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12709-2-22:2024 có hiệu lực thi hành kể từ ngày công bố theo quyết định của cơ quan nhà nước có thẩm quyền, thay thế hoặc bổ sung các quy trình giám định lâm thời trước đây đối với loài dịch hại này.