Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-14:2024 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây hại thực vật - Phần 2-14: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định Virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ringspot virus - TRSV)

Tóm tắt mang tính tham khảo.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-14:2024 được ban hành năm 2024 quy định chi tiết về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây hại thực vật - Phần 2-14: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định Virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ringspot virus - TRSV). Đây là văn bản kỹ thuật chuyên ngành quan trọng, thiết lập các tiêu chuẩn thống nhất nhằm phục vụ công tác kiểm dịch thực vật, bảo vệ sản xuất nông nghiệp và ngăn ngừa sự lây lan của đối tượng dịch hại nguy hiểm này tại Việt Nam. Phạm vi điều chỉnh và đối tượng áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình phát hiện và giám định virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ringspot virus - TRSV) gây hại trên các loại cây chủ. Đối tượng áp dụng bao gồm các tổ chức, cá nhân thực hiện công tác kiểm dịch thực vật, giám định sinh vật hại, nghiên cứu khoa học và các cơ quan quản lý nhà nước liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật. Thông tin chung về Virus đốm vòng thuốc lá (TRSV) TRSV là một loại virus thuộc chi Nepovirus, họ Secoviridae. Virus này có phạm vi ký chủ rất rộng, gây hại nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao như thuốc lá, đậu tương, việt quất, nho, anh đào và nhiều loại cây cảnh khác. Triệu chứng điển hình do TRSV gây ra bao gồm các vết đốm vòng hoại tử, khảm lá, biến dạng lá, còi cọc và có thể dẫn đến chết cây, gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng nông sản. Quy trình thu thập, bảo quản và chuẩn bị mẫu giám định Thu thập mẫu: Mẫu kiểm tra phải được thu thập từ các bộ phận của cây có biểu hiện triệu chứng nghi ngờ nhiễm virus như lá, thân, quả hoặc hạt. Đối với các lô hàng nhập khẩu hoặc vận chuyển nội địa, việc lấy mẫu phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về kiểm dịch thực vật hiện hành để đảm bảo tính đại diện. Bảo quản mẫu: Mẫu sau khi thu thập cần được đựng trong túi nilon chuyên dụng, ghi nhãn đầy đủ thông tin và vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm. Trong trường hợp chưa phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 độ C đến 8 độ C trong thời gian ngắn hoặc bảo quản sâu ở nhiệt độ âm 20 độ C đến âm 80 độ C để tránh phân hủy RNA của virus. Chuẩn bị mẫu: Tiến hành nghiền mẫu thực vật trong dung dịch đệm chiết thích hợp theo tỷ lệ quy định để giải phóng các hạt virus phục vụ cho các bước phân tích tiếp theo. Các phương pháp giám định và phát hiện TRSV Tiêu chuẩn quy định việc kết hợp nhiều phương pháp khác nhau để đảm bảo độ chính xác cao nhất trong quá trình giám định: Kiểm tra triệu chứng lâm sàng: Quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc kính lúp các biểu hiện bệnh trên cây chủ như đốm vòng, hoại tử, khảm lá hoặc biến dạng sinh trưởng. Đây là bước sàng lọc ban đầu nhưng không dùng làm căn cứ kết luận duy nhất do triệu chứng có thể trùng lặp với các tác nhân khác. Phương pháp cây chỉ thị (Biological indexing): Sử dụng dịch chiết từ mẫu bệnh truyền cơ học lên các cây chỉ thị mẫn cảm (như Chenopodium amaranticolor, Nicotiana tabacum) để quan sát sự xuất hiện của các triệu chứng đặc trưng sau một thời gian nuôi cấy trong điều kiện nhà lưới kiểm soát. Phương pháp huyết thanh học (ELISA): Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA với các kháng thể đặc hiệu để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên TRSV trong dịch chiết mẫu cây. Đây là phương pháp phổ biến, có độ tin cậy cao và phù hợp cho việc sàng lọc số lượng mẫu lớn. Phương pháp sinh học phân tử (RT-PCR): Thực hiện phản ứng phiên mã ngược kết hợp khuếch đại chuỗi polymerase (RT-PCR) sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện đoạn gen mục tiêu của TRSV. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cực cao, giúp khẳng định chính xác sự hiện diện của virus ngay cả ở nồng độ thấp. Tiêu chuẩn xác định kết quả giám định Mẫu được kết luận là nhiễm Virus đốm vòng thuốc lá (TRSV) khi có kết quả dương tính với ít nhất một trong các phương pháp khẳng định như RT-PCR (cho vạch điện di đúng kích thước lý thuyết) hoặc kết quả dương tính rõ ràng qua thử nghiệm DAS-ELISA (giá trị OD vượt ngưỡng giới hạn phát hiện). Mọi kết quả giám định phải được lập thành biên bản, ghi chép đầy đủ các thông số kỹ thuật, hóa chất sử dụng và lưu trữ hồ sơ theo đúng quy định của phòng thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025. Hiệu lực thi hành Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-14:2024 có hiệu lực kể từ ngày ban hành. Các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm dịch thực vật có trách nhiệm cập nhật trang thiết bị, đào tạo nhân lực và áp dụng thống nhất quy trình này trong hoạt động giám định thực tế nhằm đảm bảo tính chính xác và pháp lý của kết quả thử nghiệm.